生物材料表面细胞黏附是由表面吸附蛋白介导的,材料表面亲疏水性对表面吸附蛋白质的构象具有重要影响,因而与细胞相容性有着密切联系。尽管有研究认为材料表面亲疏水性与细胞相容性关系不大,但大部分研究均表明适度亲水性的表面有利于细胞黏附和铺展,而亲水性太强或疏水性太强的表面均不利于细胞的黏附与铺展,这主要是因为材料表面亲疏水性直接影响蛋白质在材料表面的黏附数量和构象。亲水性很强的表面不利于蛋白质的吸附,从而不利于细胞黏附。对于疏水性很强的材料表面,一方面,非黏附蛋白(如白蛋白)在材料表面的吸附阻碍了黏附蛋白的吸附;另一方面,吸附在高度疏水材料表面的黏附蛋白,其分子链的天然构象遭到破坏,致使蛋白质分子链中与细胞膜表面整合素相结合的活性位点(RGD)无法完全暴露,不利于细胞黏附。只有在亲水性适度表面,黏附蛋白既可吸附于材料表面,又保持分子链天然构象,使细胞黏附多肽RGD较多地暴露出来,从而有利于细胞在材料表面的黏附和铺展。

壳聚糖是一种生物衍生的带正电荷多糖,具有优良的生物相容性和降解性能,在软骨组织工程,人工皮肤等领域得到广泛研究。近年来,由于其优良的成膜性能和良好的光学性能,壳聚糖膜在角膜组织工程及角膜修复材料研究领域得到越来越广泛重视,本课题组也开展了壳聚糖在角膜修复材料领域的相关应用研究。对壳聚糖及其复合膜的表面性能进行测试与综合分析,研究材料表面亲水性、自由能、化学基团及其分布和表面形貌,并对其表面特性进行改性,对于角膜修复材料及其临床应用研究均具有重要的理论意义。

低温等离子体处理

低温等离子体可以在室温下对材料进行表面改性处理,在材料表面引入自由基或活性官能团,其作用区域仅限于材料表面100nm范围以内,而对材料本体性能不产生影响。近年来已广泛应用于生物材料的表面改性研究。

本文采用表面接触角测试、光电子能谱分析、原子力显微镜等对壳聚糖膜表面化学基团及其空间分布、表面形貌等特性进行表征,对壳聚糖膜表面物化特性与其生物学特性之间的关系进行初步探讨。并采用氧化性O2低温等离子体对壳聚糖膜进行表面处理,以提高其表面亲水性,对等离子体表面改性的机理进行分析。

O2等离子体处理对壳聚糖膜表面性能的影响

O2等离子体处理时间对表面接触角和自由能的影响

等离子体处理能够在材料表面形成活性自由基,这些活性自由基与空气中的氧气、水汽等反应,从而在材料表面引入极性基团,这些极性基团的引入能够有效改善材料表面的亲水性和自由能。表面接触角测试是表征材料表面亲水性的有效途径。图1-1(a)是不同等离子体处理时间下,壳聚糖膜表面接触角随处理时间的变化。可以看出,在100W等离子体功率条件下,短短10s的等离子体处理就可以使壳聚糖膜表面水接触角从约90°下降到58°,说明其表面亲水性得到了改善,继续延长等离子体处理时间,可以进一步改善其表面亲水性,处理时间为30s时,其接触角约为45°,60s的等离子体处理可使接触角降到35°,120s的等离子体处理可使接触角进一步降低。根据文献报道,生物材料的表面接触角处于30°~50°之间,有利于细胞的黏附和繁殖,因此,采用O2等离子体处理壳聚糖膜,在100W的功率条件下,60s的处理时间已经足够了。壳聚糖膜表面二碘甲烷的接触角在等离子体处理下具有同样的下降变化趋势,在60s以后壳聚糖膜表面二碘甲烷的接触角已经几乎不再下降。

图1-1 O2等离子体处理时间对壳聚糖膜表面接触角(a)和表面自由能(b)的影响 

表面自由能对材料表面的细胞黏附性能非常重要,图1-1(b)是在其他条件相同情况下,壳聚糖膜表面自由能(包括其色散和极性分量)随等离子体处理时间变化情况,可看出,未处理壳聚糖膜的表面自由能非常低,且其自由能的绝大部分为色散分量,极性分量非常小,这是因为壳聚糖膜表面的极性基团翻转转移到壳聚糖膜的内部,而暴露在外的主要是一些非极性基团。经过O2等离子体处理10s后,其表面能得到了很大的增加,且随处理时间的延长,表面自由能有继续增加的趋势。在表面能的增加中,绝大部分为极性分量的增加,而色散分量基本保持不变,这主要是因为O2等离子体处理在样品表面引入了活性自由基,这些活性自由基与空气中的氧气、水汽等反应形成含氧的极性基团,使得样品表面极性增强。表面自由能的适当增加有利于改善材料表面细胞黏附。

O2等离子体处理对壳聚糖膜表面化学状态的影响

等离子体处理在材料表面引入活性自由基,当材料暴露大气后,这些活性性自由基与空气中的氧气、氮气、水汽等进行反应,在材料表面引入极性基团。图2-1是壳聚糖膜等离子体处理前后的表面XPS全谱分析,可以看出,样品表面元素主要为O、N、C,随着等离子体处理,表面元素没有发生变化,但是元素的相对含量发生了较大的变化。样品表面O的含量增加很大,而C的含量则相对减少,而N的变化不明显。

图2-1 O2等离子体处理前后壳聚糖膜表面XPS谱,(a)处理前,(b)处理后(100W,60s) 

图2-2是O2等离子体处理时间对壳聚糖膜表面元素含量的影响,可以看出,壳聚糖膜经过O2等离子体处理后,表面C的含量减少,表面O的含量得到了极大的增加,且有一定量的N的增加,但60s后,变化趋缓,说明在表面形成了更多的含O基团,含O极性基团的引入能够增加其表面亲水性,这与表面接触角的测试结果相对应。表面O的增加主要有两个方面的来源,一为系统中引入的高纯O2,在等离子体处理过程中,形成各种含O的自由基和分子碎片等,轰击样品表面,在样品表面形成含O基团;此外,样品经过等离子体处理后,在表面形成了各种活性自由基,活性自由基会与空气中的O2和水汽等反应,引入含O基团。对于非反应性气体,后者是最主要的表面活化过程。样品表面N含量增加也是由于表面活性自由基与空气中N2反应的结果。

图2-2 O2等离子体处理时间对壳聚糖膜表面元素的影响

图2-3是壳聚糖膜样品等离子体处理前后的C1s高分辨谱,未处理样品表面C主要以C-C/C-H、C-O和C=O三种存在的化学状态,这是与壳聚糖的分子结构相对应的。随着等离子体处理,样品表面引入了更多的O,使得样品表面C元素的化学状态发生了大的变化。对比处理前后的谱图可以看出,除了其三种化学状态的相对比例发生了变化外,在高结合能端甚至出现了羧酸基团COO-,这主要是由于等离子体处理下形成的活性自由基与空气中的O2反应形成的。C-O的比例增加很大,这是等离子体中的粒子能量使得C-C键发生断裂,形成活性自由基,与O2等反应,形成C-OH、COOH等极性基团,使得表面以C-O、C=O和COO-化学状态存在的C的比例增加。

图2-3 O2等离子体处理前后壳聚糖膜表面C1s XPS,(a)处理前,(b)处理后(60s/100W) 

等离子体处理对表面形貌的影响

表面平整光洁的材料与组织接触后,周围形成的是一层较厚的与材料无结合的包囊组织。粗糙的材料表面促使细胞和组织与材料表面附着和紧密结合。粗糙表面一方面增加细胞、组织与材料表面的接触面积,此外,还会对细胞形成择优黏附,有报道指出,当材料表面粗糙度为1~3µm时,可以显著促进细胞在材料表面的附着和生长。本实验分别采用SEM和AFM对壳聚糖膜的表面形貌进行观察。图3-1(a)为SEM图,可以看出,壳聚糖膜表面除了有部分溶剂挥发残留微孔外,较为光滑平整。图3-1(b)为壳聚糖膜表面原子力显微镜图,AFM图测试表明其表面粗糙度约为3.5nm,这种光滑均一的表面对壳聚糖膜的透光性是有利的,但作为角膜修复材料使用,为了增加细胞在材料表面的黏附,有必要提高材料表面的粗糙度。

图3-1 壳聚糖膜表面SEM(a)、AFM(b)和粗糙度(c) 

等离子体处理可以在表面形成一定的粗糙度,粗糙度的适当增加可以为材料提供更好的细胞黏附表面,本实验分别采用SEM和AFM对壳聚糖膜经等离子体处理前后的表面形貌进行了观察。图3-2为在相同等离子体处理功率,不同等离子体处理时间下处理前后的壳聚糖膜表面SEM图。可以看出,未处理壳聚糖膜样品表面较为均匀,但存在一定的小孔,可能是在成膜过程中,溶剂挥发不均匀而造成的。经过O2等离子体处理60s后,壳聚糖膜表面变得平整均匀,说明等离子体对壳聚糖膜存在表面清洁作用。等离子体处理120s后,壳聚糖膜表面有少量烧灼痕迹,这是等离子体处理时间过长引起表面刻蚀而造成的。因而对于等离子体处理时间的把握非常重要。

图3-2 壳聚糖膜表面经O2等离子体处理后的SEM图 

图3-3分别为采用100W和150W等离子体处理功率下得到的壳聚糖膜表面SEM图,可以看出100W的等离子体处理壳聚糖膜表面光滑平整,而采用150W处理后,其表面部分位置出现了烧灼痕迹,因而,对于等离子体处理,功率大小的选择非常重要,功率过大容易造成表面刻蚀,这与前面的XPS、表面接触角等测试结果是相对应的。

图3-3 不同O2等离子体处理功率下的壳聚糖膜表面SEM图,(a)100W,(b)150W 

图3-4为经过氧气等离子体处理后的壳聚糖膜表面AFM,可以看出,因为等离子体刻蚀的作用,壳聚糖膜表面变得较为粗糙,表面粗糙度Rms增加为5.252nm。表面粗糙度的适当增加将有利于材料表面细胞的黏附。

图3-4 表面O2等离子体处理(100W,60s)壳聚糖膜的表面AFM,(a)扫描面积 10×10µm,(b)扫描面积5×5µm,(c)扫描面积2.5×2.5µm,(d)表面粗糙度计算